二代测序数据处理(一)数据格式说明

发布于 2022-01-17  492 次阅读


一、FASTA(.fa) 储存参考数据集

从零开始完整学习全基因组测序(WGS)数据分析:第2节 FASTA和FASTQ

  • 基本单元
  • 序列所表示的基因名:>ENSMUSG00000020122|ENSMUST00000138518,后可接空格表示注释前缀
  • 具体序列信息:CCCTCCTATCATGC……GGGCCCACCTGTTCTCTGGT
  • 基因名独占一行,序列信息为基因名后一行至下一个 > 基因名标记前
>ENSMUSG00000020122|ENSMUST00000138518
CCCTCCTATCATGCTGTCAGTGTATCTCTAAATAGCACTCTCAACCCCCGTGAACTTGGT
TATTAAAAACATGCCCAAAGTCTGGGAGCCAGGGCTGCAGGGAAATACCACAGCCTCAGT
TCATCAAAACAGTTCATTGCCCAAAATGTTCTCAGCTGCAGCTTTCATGAGGTAACTCCA
GGGCCCACCTGTTCTCTGGT

 

  • FASTA文件为基本单元的简单罗列
>ENSMUSG00000020122|ENSMUST00000138518
CCCTCCTATCATGCTGTCAGTGTATCTCTAAATAGCACTCTCAACCCCCGTGAACTTGGT
TATTAAAAACATGCCCAAAGTCTGGGAGCCAGGGCTGCAGGGAAATACCACAGCCTCAGT
TCATCAAAACAGTTCATTGCCCAAAATGTTCTCAGCTGCAGCTTTCATGAGGTAACTCCA
GGGCCCACCTGTTCTCTGGT
>……
……
>ENSMUSG00000020122|ENSMUST00000125984
GAGTCAGGTTGAAGCTGCCCTGAACACTACAGAGAAGAGAGGCCTTGGTGTCCTGTTGTC
TCCAGAACCCCAATATGTCTTGTGAAGGGCACACAACCCCTCAAAGGGGTGTCACTTCTT
CTGATCACTTTTGTTACTGTTTACTAACTGATCCTATGAATCACTGTGTCTTCTCAGAGG
CCGTGAACCACGTCTGCAAT
>……
……

 

二、FASTQ(.fq) 储存原始测序数据

  • 每四行成为一个独立的单元称之为read;FASTQ文件为read的简单罗列
  • 第一行:以‘@’开头,是这一条read的唯一标识符
  • 第二行:测序read的序列,由A,C,G,T和N这五种字母构成,N代表的是测序时那些无法被识别出来的碱基;
  • 第三行:以‘+’开头,用以兼容旧版格式
  • 第四行:测序read的质量值,Q = -10log(测序错误率),字符=chr(ord('!')+Q),上限为 ~
@DJB775P1:248:D0MDGACXX:7:1202:12362:49613
TGCTTACTCTGCGTTGATACCACTGCTTAGATCGGAAGAGCACACGTCTGAA
+
JJJJJIIJJJJJJHIHHHGHFFFFFFCEEEEEDBD?DDDDDDBDDDABDDCA

 

三、GTF(.gtf) 描述基因和转录本的信息

GTF文件格式简介

  • 头部有 # 开头的注释行
  • 主体为 \t 分隔的具有九列的表格,空值用 . 填充
  • 第一列 seqid 代表染色体的ID
  • 第二列是 source 代表基因结构的来源
  • 第三列是feature, 代表区间对应的特征类型,如外显子等
  • 第四、五列为区间的起止坐标
  • 第六列是 score
  • 第七列是 strand, 代表正负链的信息, +表示正链,-表示负链,?表示不清楚
  • 第八列是 phase,当描述的是CDS区间信息时,需要指定翻译时开始的位置,取值范围有0,1,2两种
  • 第九列是attributes, 表示属性,键值对间以分号分隔,键值对内以空格分隔
#!genome-build GRCh38.p12
#!genome-version GRCh38
#!genome-date 2013-12
#!genome-build-accession NCBI:GCA_000001405.27
#!genebuild-last-updated 2018-01
1       ensembl_havana  gene    65419   71585   .       +       .       gene_id "ENSG00000186092"; gene_version "6"; gene_name "OR4F5"; gene_source "ensembl_havana"; gene_biotype "protein_coding";

 

四、IDX(.idx) 基因组比对工具HISAT2的索引文件

RNA-Seq基因组比对工具HISAT2

  • 使用 hisat2-build 工具从.fa文件建立
export FADIR=/opt/human_grch38/dna
export FANAME=Homo_sapiens.GRCh38.dna.chromosome
export IDXDIR=/opt/human_grch38/hisat2_idx

export FILELIST=$FADIR/${FANAME}.1.fa,$FADIR/${FANAME}.2.fa,$FADIR/${FANAME}.3.fa,$FADIR/${FANAME}.4.fa,$FADIR/${FANAME}.5.fa,$FADIR/${FANAME}.6.fa,$FADIR/${FANAME}.7.fa,$FADIR/${FANAME}.8.fa,$FADIR/${FANAME}.9.fa,$FADIR/${FANAME}.10.fa,
export FILELIST=${FILELIST}$FADIR/${FANAME}.11.fa,$FADIR/${FANAME}.12.fa,$FADIR/${FANAME}.13.fa,$FADIR/${FANAME}.14.fa,$FADIR/${FANAME}.15.fa,$FADIR/${FANAME}.16.fa,$FADIR/${FANAME}.17.fa,$FADIR/${FANAME}.18.fa,$FADIR/${FANAME}.19.fa,$FADIR/${FANAME}.20.fa,
export FILELIST=${FILELIST}$FADIR/${FANAME}.21.fa,$FADIR/${FANAME}.22.fa,$FADIR/${FANAME}.MT.fa,$FADIR/${FANAME}.X.fa,$FADIR/${FANAME}.Y.fa
echo **************************************
echo $FILELIST
echo **************************************
hisat2-build -p 8 $FILELIST $IDXDIR/GRCh38.hisat2.idx

 

五、Sam/Bam(.bam) 记录比对的具体情况

Sam/Bam文件格式详解

六、相关参数说明

基因组的那些事儿

  • 测序深度:30x;每个碱基平均被测次数,相关研究表明5~60x中 30x对于后续分析可以达95%置信度
  • 测序策略:PE150;PE双端测序、一条序列正反测两次;150每次测150bp,双端测一条片段共300bp
  • 350bpcDNA建库:将DNA用超声波随机打断成350bp,加接头,作为测序前的准备工作

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